PEI 配置方法及轉染流程
2025-04-28使用方法
PEI MAX粉末配置方法:
1> 將1g PEI MAX 40K放入盛有900 mL水的玻璃燒杯中
2>放入攪拌轉子,放置于磁力攪拌器上,設置攪拌程序以形成一個較小的漩渦
3> 等待PEI MAX 40K溶解,通常需要5分鐘左右
4> 用25 mL塑料移液管加入1 N NaOH溶液滴定至pH 6.9~7.1
5>如果不小心超過7.1,則使用1N的鹽酸和新的塑料移液管將pH重新滴定至6.9~7.1
6>將溶液轉移到1L玻璃量筒中,加入水定容至1L
7>用無菌真空過濾膜過濾配制的轉染試劑溶液
8>按需分裝,4°C儲存
注:未經配制的粉末有效期為2年。
配置成液體后分裝在合適的瓶子中,并且保存在4℃的轉染試劑將可在6個月之內保持性能,如僅用于蛋白定性研究,分裝的轉染試劑可延長有效使用期至1年。
經過馴化的無血清培養懸浮細胞轉染流程
一. 準備工作
轉染前2~3小時,種植細胞密度為 1X10?/mL 于培養容器中。
二. 轉染步驟
(以250 mL搖瓶為例,轉染前種植細胞總體積為25mL,最終總培養體積為50mL) ,準備PEI-DNA 轉染混合物(按照以下操作順序):
1>在含有2.5mL(25mL 的 10%)稀釋液的 EP 管中加入50ug質粒DNA(質粒用量建議在 1~2ug/10?細胞之間優化,此處使用1ug/10?細胞)
2>輕輕地混勻/振蕩溶液
3>在DNA溶液中加入50~200uL PEI轉染試劑(PEI/DNA 的比例建議在1~4:1之間優化,初次推薦使用2:1或3:1)
4>渦旋振蕩5秒鐘
5>將管子靜置于超凈工作臺10~15分鐘,使 PEI-DNA 復合物形成(建議共孵育時間不超過20分鐘)
6>用移液器輕輕上下吹打混合液3次
注:邊晃動搖瓶,邊將PEI-DNA 混合液加入更換了培養基的轉染孔中,確保 PEI-DNA 復合物均勻分布,防止局部濃度過高。
三. 孵育培養
將細胞培養瓶放入培養箱,搖瓶培養2~3小時后,加入25 mL新鮮培養基,繼續培養。
通常,在轉染后36-48小時可檢測到重組蛋白表達或包裝的病毒顆粒。轉染后72-96小時可觀察到更大產量。