問：如何搭配流式抗體熒光標記?
答：流式抗體熒光標記搭配主要由3個因素決定的：流式細胞儀能檢測多少個通道、需要同時檢測檢測多少個指標、廠家的抗體有多少種熒光標記。如果流式細胞儀的通道越多，那么同一份樣本能同時做的表面/胞內標志就越多。
 

問：eBioscience公司提供了哪些熒光標記抗體？
答：eBioscien公司提供FITC,PE,PE-Cy5,PE-Cy5.5,PE-Cy7,APC,APC-Cy5.5,APC-Cy7,Cy5, PacificBlue?,andAlexaFluor?488,647and700等熒光標記抗體。另外還有更具優勢的eFluor? 有機染料和eFluor? 納米晶體(NC)標記抗體。如eFluor? 450，eFluor? 660，PerCP-eFluor? 710，APC-eFluor? 780系列產品已經完美替代 了Pacific Blue?， Alexa Fluor? 647，PerCP-Cy5.5和APC-Alexa Fluor? 750相關產品。
 

問： eBioscience公司提供抗體濃度是多大？
答： eBioscience公司的提供抗體包括兩種規格：ug和tests. 在ug規格的抗體中，親和純化、生物素標記、功能純化生物素標以及FITC和Alexa Fluor? 488標記的抗體濃度為0.5 mg/ml；APC、PE、Alexa Fluor? 647,700和tandem標記的抗體濃度為0.2 mg/ml；功能純化抗體濃度是1 mg/ml；而tests規格的抗體濃度標注在說明上，通常建議每test為20ul。
 

問：流式細胞實驗的對照應該如何設置？什么是同型對照？
答：

①在應用流式技術檢測細胞表面抗原時，我們通常要設的一個對照就是同型對照。同型對照：使用與熒光標記抗體相同來源、相同標記、相同劑量和亞型的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性結合到細胞表面而產生的背景染色。例如應用eBioscience公司的FITCanti-humanCD3：CatNo.11-0037，抗體亞型MouseIgG2a做流式染色；建議用FITCMouseIgG2a,KIsotypeControl：CatNo.11-4724作為同型對照。
②細胞因子的流式檢測時，由于細胞經過了培養刺激活化的處理，為保證測得結果的準確性和客觀性，除了同型對照外，還需另設置未刺激對照和刺激對照。未刺激對照：激活時由于BFA等的存在抑制了胞內蛋白的轉運，因此在激活過程中產生的抗原與細胞因子會滯留胞內，未刺激對照也應包含BFA等阻斷劑。激活對照：激活對照使用細胞表面表達CD69來評價激活與否，如果未達到CD69期望的水平，則激活步驟出了問題，某一試劑可能失活，過期，制備不當或溶劑污染，需制備新鮮刺激劑重新實驗。
 

問：間接免疫熒光標記法如何設置同型對照？
答：同型對照的目的是消除由于抗體非特異性結合到細胞表面而產生的背景染色，而確保檢測結果的真實性。在采用間接免疫熒光標記法流式檢測時，所設的同型對照是與一抗相同劑量、相同亞型和相同生物素標記（或純化）免疫球蛋白，之后的熒光標記過程與實驗檢測組相同即可。eBioscience公司提供了各色標記和純化的同型對照免疫球蛋白。
 

問：為什么流式細胞術多色分析時要進行熒光補償調整?
答：在進行流式細胞術多色分析時,待測細胞通常攜帶兩種或兩種以上的熒光素,如異硫氰熒光素(FITC)、藻紅蛋白(PE)、別藻紅蛋白(PECY5)等。這些熒光素被激光激發后發出不同波長的熒光,理論上每一種熒光通過選擇恰當的濾光片可被相應的檢測器檢測到,而不受其他熒光的干擾。但目前這些熒光染料都具有寬發射譜性質,盡管它們的發射峰各不相同,但發射譜范圍有一定的重疊,也就是說,相鄰的檢測器會檢測到彼此的熒光信號,例如,FITC檢測器會檢測到少量的PE光譜,而PE檢測器會檢測到較多的FITC光譜。這樣就影響了檢測結果的準確性,因此,多色分析時必須進行光譜重疊的校正。
 

問：如何檢測胞內因子抗體的特異性？
答：可以應用過量的相應細胞因子先封閉該胞內因子的熒光標記抗體，或者先用不帶熒光標記的相應因子抗體先封閉細胞，進一步流式操作作對照；另外同型對照也可以判斷細胞的固定、破膜的效果以及非特異性背景的影響。
 

問：為什么用CD452SSC設門法進行流式細胞術白血病表型分析?
答：免疫分型所用的樣本通常是骨髓,由于骨髓中各種大小和分化程度的細胞均有,只根據細胞大小和顆粒密度很難將不同組分的細胞區分開。而造血系統細胞的CD45表達的熒光強度(FI)與細胞分化程度有一定關系,即分化程度高的成熟白細胞其CD45的FI也高,分化程度低的細胞其FI也低,而紅系細胞的FI最低。在成熟白細胞中,各類細胞其 CD45的FI亦不相同,其中淋巴細胞和單核細胞的FI高于中性粒細胞。因此,根據各類細胞CD45的FI和顆粒密度不同,采用CD452SSC(側向角散射)設門法可以將原始細胞(低FI,低或高SSC)、淋巴細胞(高FI,低SSC)、單核細胞(高FI,中等SSC)、中性粒細胞(低FI,高 SSC)、紅系細胞(最低FI,低或高SSC)和細胞碎片(最低FI,最低SSC)清楚地區分開。
 

問：在進行多色流式分析時，如何選擇熒光染料標記抗體？
答：當我們在進行多色流式分析的時候，對分析成功的一個關鍵影響因素是每個抗體選擇何種熒光染料標記。通常會有很多可行的結合，我們在做選擇的時候有很多的因素需要我們去考慮。對任何單克隆抗體，其陰性和陽性的信噪比相差四到六倍都取決于熒光素的使用。高密度表達的抗原我們可以應用任何熒光素標記的抗體來檢測，低密度表達的抗原就需要我們應用高信噪比的熒光素，大家可參照eBioscience的Best Protocols? Fluorescent Dyes Chart or our Fluorochrome Poster進行選擇。
 

問：流式分析時，是選擇單克隆抗體還是多克隆抗體好？
答：熒光抗體的選擇將直接影響流式檢測的最終結果。熒光抗體的優劣由兩方面的因素決定，即熒光素特性和抗體特異性。熒光素的選擇如前所述。那我們側重來看抗體選擇對結果的影響。流式細胞術是抗體產品最重要的用途，而目前在流式細胞中應用的抗體則主要是單克隆抗體，單克隆抗體因其高度特異性、高靈敏度及高親和力而比多克隆抗體有著明顯的優勢。
 

問：我想購買eBioscience的流式抗體，我可以用什么抗體標記特定的細胞類型用于流式細胞儀分析？
答：使用eBioscience老鼠和人類的CD圖表，以幫助確定您感興趣的不同抗原的表達模式。
 

問：流式細胞儀分析時如何區分活細胞和死細胞？
答：區分活細胞和死細胞可以使用7-AAD的活力染料（貨號00-6993）或碘化丙啶（PI）染色溶液（貨號00-6990）。 7-AAD或PI可與死細胞的細胞核結合，而活細胞的核酸將不會被染色。通過分析收集到的數據，就可去除死細胞。如需染細胞內蛋白質，可使用染料eFluor450，660或780。
 

問：莫能菌素和布雷菲德菌素A有什么用處？
答：這些化合物能在細胞培養時激活胞內趨化因子和細胞因子表達，從而進行流式分析。莫能菌素（貨號00-4505）和布雷菲德菌素A（貨號00-4506）作為蛋白質運輸抑制劑，能夠抑制高爾基體細胞分泌的蛋白，從而導致內質網或高爾基體的細胞因子的積累。細胞通常在細胞培養時，添加這兩種化合物質之一，以促進細胞內檢測蛋白水平的積累。已知莫能菌素能阻止從內側高爾基跨囊泡運輸。布雷菲德菌素A已報道能夠阻止從內質網的蛋白運輸。
 

問：請問能否震蕩混勻抗體或重組蛋白？
答：并不推薦震蕩混勻蛋白溶液(例如重組蛋白和抗體)以免改變其活性。另外在運輸過程中會有液體散布在管壁上，建議使用前將抗體瞬離以獲取最大體積。
 

問：請問能否渦旋已經標記了抗體的樣品？
答：可以。但不要時間過長(快速渦旋)，以免對細胞有損傷。
 

問：eFluor? 有機染料和eFluor? 納米晶體(NC)的區別是什么？
答：eFluor 有機染料 (eFluor 450, APC-eFluor 780, PerCP-eFluor 710, eFluor 710)是傳統的熒光染料，而NC是納米晶體/量子點，是納米級的半導體顆粒，它具有與一般染料分子不同的熒光特性，納米晶體發出的光的顏色主要取決于顆粒的大小。
 

問：eFluor有機染料和eFluor納米晶體染料有一致的緩沖液嗎？
答：1.eFluor有機染料可使用傳統熒光染料的流式染色緩沖液。2.對于eFluor納米晶體，推薦使用的緩沖液貨號為cat00-3222，經過驗證發現，當使用PBS-based的緩沖液時，我們能看到微弱熒光，但若使用納米晶體染色緩沖液（cat#00-3222），可明顯增強熒光信號。
 

問：eFluor有機染料和納米晶體染料是否能用于胞內染色？
答：完全可以。
 

問：用eFluor有機染料或納米晶體染料都不能檢測我的細胞信號，請問還有其他的選擇嗎？
答：根據你要分析的細胞來決定。如果細胞活力不重要的話，你可把染色的細胞樣品避光儲存在4度，或者冰上過夜，次日再檢測。將樣品用2%的福爾馬林（PBS稀釋）固定30分鐘。對于固定的方法，建議將細胞重懸于100ul的eFluor納米晶體染色緩沖液或100ul的eBisocienceIC固定液（cat#00-8222），孵育20-30分鐘，然后用eFluor納米晶體染色緩沖液（cat#00-3222）洗1-2次。固定完后，4度避光保存直至分析檢測。
 

問：為什么用APC-eFluor? 780替換APC-Cy7 和APC-Alexa Fluor? 750，用eFluor? 660替換Pacific Blue? with eFluor? 450 和Alexa Fluor? 647？
答：主要是由于APC-eFluor? 780的熒光強度高，補償小，光穩定性高，故替代了APC-Cy7 和④APC-Alexa Fluor? 750。eFluor? 660同樣是由于熒光強度高，補償小，光穩定性高的特點替代④了Pacific Blue? with eFluor? 450 和Alexa Fluor? 647。
 

問：eFluor有機染料能否冷凍？
答：eFluor有機染料和其他的有機染料一樣不能冷凍。
 

問：eFluor有機染料是否存在光不穩定性？
答：和其它染料一樣，eFluor有機染料對光不穩定，建議盡量減少曝光時間。
 

問：eFluor有機染料的激發光/發射光波長是多少？
答：eFluor有機熒光染料均是以發射波長來命名，因此根據有機燃料的名稱就可知曉激發光/發射光波長，如eFluor? 450系列的激發光即為450nm。
 

問：eFluor? 605NC, eFluor? 625NC and eFluor? 650NC標記抗體與其他熒光標記抗體的區別在于？
答：①補償小。②高信噪比。③光穩定性強。④可與其他熒光染料同時使用。
 

問：當使用eFluor? 605NC, eFluor? 625NC and eFluor? 650NC標記抗體時，需要考慮哪些因素？
答：

①為了獲得理想的熒光強度，建議不要使用PBS-based buffer 或 eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer (cat. 00-4222)，推薦使用eBioscience的eFluor? NC Flow Cytometry Staining uffer (cat. 00-3222)。
②細胞內染色：建議參照eBioscience Intracellular Staining protocol進行實驗。③長期固定：不建議長期固定，而是建議在2％的甲醛固定30分鐘。對于固定方法，建議方法為將細胞重懸于eFluor NC Flow Cytometry Staining Buffer和IC Fixation Buffer （cat#00-8222），孵育20-30分鐘。洗凈，用eFluor NC Flow Cytometry Staining Buffer (cat. 00-3222)洗1-2次。固定完后， 4度避光保存直至分析檢測。
 

問：eFluor? 605NC, eFluor? 625NC and eFluor? 650NC標記抗體可與其他熒光標記抗體共染色嗎？
答： eFluor? 605NC, eFluor? 625NC 和eFluor? 650NC標記抗體可與eBioscience任何的熒光標記抗體共染色。但是由于eFluor 605NC ，eFluor 625NC以及PE-Texas Red的激發光波長相似，因此不能用于檢測同一樣品。
 

問：檢測eFluor? 605NC, eFluor? 625NC 和 eFluor? 650NC標記抗體時，如何選擇激光？
答：盡管采用其他激發光源亦可使eFluor? 605NC, eFluor? 625NC 和 eFluor? 650NC發射熒光，但最好還是采用355nm或405nm激光，以獲得最強的熒光信號。
 

問：如何制備eFluor NC Flow Cytometry Staining Buffer(cat. 00-3222)？
答：5XeFluor NC Flow Cytometry Staining Buffer需用蒸餾水稀釋成1X。另在稀釋時，需同時添加胎牛血清或其他同等的蛋白至終濃度為3%。4°C保存。
 

問：eFluor 納米晶體是否有毒？
答：除了eFluor 700NC含有無毒成分InGaP之外，其它所有的eFluor納米晶體染料都含有不同濃度的重金屬鎘，鋅和硒。鎘具有潛在的毒性，因此需帶手套處理。強烈建議使用eFluor納米晶體染料需根據實驗室重金屬處理辦法全程采取保護措施。請切記低劑量的鎘可能不會有健康危險，但是一定不能長時間接觸。
 

問：如何處理eFluor納米晶體染料？
答：除了含有無毒性的InGaP的產品外，eFluor納米晶體染料主要是由鎘組成的，因此建議根據所在地對含重金屬物的處理規定來處理。