問：如何儲存抗體？
答：儲存抗體的條件以說明書為準，一般推薦放在4度,避免犯反復凍融。

問：如何分裝抗體？
答：為避免反復凍融,Novus推薦在儲存前先分裝抗體.分裝體積不小于20ul,以避免抗體被微管吸附.作為選擇之一,也可以BSA進行1:2 – 1:20 的稀釋.加入的蛋白可穩定抗體溶液.在進行稀釋前,稀釋液必須過濾消毒。

問：NOVUS的產品說明書中，列舉的應用中IHC, IHC-P, IHC-F分別代表什么意思？
答：NOVUS的產品說明書中，列舉的應用中如標注“IHC,IHC-P”，表明該產品只能應用石蠟包埋的樣品檢測；如果標注的是“IHC,IHC-F”，表明該產品只能應用于冰凍切片的樣品檢測；如標注了“IHC,IHC-P,IHC-F”，表明該產品既可應用于石蠟切片，也可應用于冰凍切片的樣品。

問：如果應用和種屬在說明書上未列出，怎么辦？
答：

1.可以給 technical@novusbio.com郵件，Novus會幫助確認是否有其他研究者有這方面的應用。
2.種屬未列示時，應比較免疫原和感興趣的蛋白的同源性，如同源性高于85%，表明該抗體可能會與感興趣的種屬蛋白反應。但是即使同源性很高，Novus也不對抗體的表現負責。

問：如何正確選擇合適的二抗產品?
答：選擇合適的二抗是要根據您使用的一抗決定的。一般的規則是二抗的應用種屬必須是您使用的一抗的宿主。比如，如果您使用的一抗是小鼠單克隆抗體，那么您就需要選擇一個抗小鼠的二抗。

問：Western blotting一般用于什么樣的實驗？
答：Western blotting是一個用于蛋白質分析的常規技術，它可以從蛋白混合物中檢測出目標蛋白，從而半定量或定性（無法絕對定量）的確定正常或實驗條件下細胞或組織中目標蛋白的表達情況。另外，Western blotting還可用于蛋白-蛋白、蛋白-DNA和蛋白-RNA相互作用的后續分析，并結合組分分離技術，檢測目標蛋白的定位情況，成為免疫熒光實驗的補充。          

問：如何較好的設置western內參？
答：內參即是內部參照，對于哺乳動物細胞表達來說一般是指由管家基因編碼表達的蛋白，它們在各組織和細胞中的表達相對恒定，在檢測蛋白的表達水平變化時常用它來做參照物。其作用是校正蛋白質定量、上樣過程中存在的實驗誤差，保證實驗結果的準確性。

在WesternBlotting中使用內參其實就是在WB過程中的另外用內參對應的抗體檢測內參，這樣在檢測目的產物的同時可以檢測內參的表達，由于內參在各組織和細胞中的表達相對恒定，借助檢測每個樣品內參的量就可以用于校正上樣誤差，這樣半定量的結果才更為可信。此外使用內參可以作為空白對照，檢測蛋白轉膜情況是否完全、整個WesternBlotting顯色或者發光體系是否正常。

常用的蛋白質內參有GAPDH和細胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。一般要選擇一個在處理因素作用的條件下蛋白含量不會發生改變的蛋白作內參。

另外，為了讓實驗更加嚴謹有說服力都要設計對照實驗，對照分為：陽性對照（最好有標準品（比如β-actin、GAPDH）或陽性血清）；陰性對照（測血時用相應小鼠未免疫血清（即正常血）；空白對照（不加一抗，用PBS代替）；無關對照（用無關抗體）。

問：為什么western blot band條帶的大小和預測的分子量大小不同?
答：在Western Blotting分析中，蛋白在膠中的遷移情況是依據分子量大小來決定的。但即使是這樣，Western Blot得到的條帶大小依然會和預計的分子量大小有出入。大部分常見的原因如下：
1.翻譯后修飾—比如蛋白的磷酸化，糖基化等，這些都會增加蛋白的分子量大小。
2.翻譯后剪切—比如很多蛋白首先被合成為前體形式，然后通過剪切獲得生物學活性，比如pro-caspases。
3.剪接變異體—相同的基因，經過選擇性剪接會產生不同分子量大小的蛋白。
4.相對電荷—氨基酸的組成 (帶點 vs 不帶電)
5.多聚體—比如蛋白二聚體。但是盡管相互作用很強的蛋白會出現分子量偏高的條帶，不過通常在還原（reducing）的條件下不會有問題。

問：免疫組織（細胞）化學實驗如何選擇固定劑？
答：固定劑主要有兩類：一類是有機溶劑，如甲醇、乙醇、丙酮等。它們通過強烈脫水變性蛋白，同時它們也能夠溶解脂類物質，因此產生通透效應。另一類為交聯劑，如甲醛、多聚甲醛、戊二醛等，它們導致細胞內分子相互連接成網狀結構，從而維持在原位上。這兩類固定劑各有優缺點，交聯劑比有機溶劑更易于保持細胞的結構，但交聯可能會破壞一些細胞組分的抗原性。同時交聯劑固定的細胞需要通透處理，才能讓抗體穿越膜結構與胞內抗原結合。醇類固定的優勢在于蛋白變性完全，對抗原的保存性好，能充分暴露出抗原。醇類固定的細胞不需要再通透。

在免疫細胞(組織)化學實驗中選擇哪種固定方法，先要考慮所檢測抗原在細胞中的定位，通常膜組分的蛋白需要用多聚甲醛固定。其他蛋白往往憑經驗選擇固定劑，可以試用兩種方法，然后選擇較好的一種。

問：在做免疫熒光、免疫組織（細胞）化學實驗時該如何設置對照？
答：

1.陰性對照：陰性對照可以了解背景熒光和非特異性染色，當待檢標本呈陽性結果時，陰性對照就更加重要，用以排除假陽性。較理想的陰性對照檢測遺傳背景相同但僅僅不表達所研究抗原的細胞，例如把某個蛋白已敲除的細胞或動物組織樣品。但這樣的標本不一定存在或很難找到，常見的陰性對照也可以是針對一抗的PBS對照或來自同一種屬動物的血清對照。

2.陽性對照：用已知抗原陽性的切片與待檢標本同時進行免疫細胞化學染色，這種陽性對照可驗證Protocol，排除實驗過程中出現的差錯。另一種陽性對照可以是在細胞內過表達所研究的抗原。同時也可以在這個抗原上接上商業化的表達標簽，如Flag, Myc, His tag等。

問：什么是免疫熒光雙標記，如何進行熒光雙標實驗？
答：免疫熒光雙標記（Double Immunofluorescence）是用兩種不同熒光染料標記的抗體同時檢測兩種抗原。標記這兩種抗體的熒光素具有不同的顏色（激發和發射波長不同），通過熒光顯微鏡可以在同一細胞上分別觀察到兩種抗原，并可通過圖像處理軟件將它們同時呈現在一張圖片上。

由于在同一個樣本使用兩種染料，為此就要求每一種檢測試劑僅能識別一種抗原。主要有兩種方法能夠達到這一目的。最確定的方法就是直接標記一抗，如其中一種標記FITC，另一種標記Texas紅，一般會有滿意的結果。第二種方法是應用兩套種屬特異性的檢測試劑。在進行這類進行熒光雙標前，最好先驗證單標對特定組織或細胞是有效的。在操作上與單標方法并無不同，但兩種一抗必須來源于不同種屬的動物，且兩種二抗不能存在交叉反應。

問：免疫熒光實驗中用于標記抗體的熒光素有哪些，在選擇上要考慮的因素有哪些？
答： 以下列舉幾種常用的熒光素：
1. FITC（Fluorescein） Excitation 495nm，Emission 525nm，黃綠色熒光；
2. Rhodamine (TRITC) Excitation 552nm，Emission 570nm，橙紅色熒光；
3. R-Phycoerythrin (PE) Excitation 488nm，Emission 578nm，橙紅色熒光；
4. Texas Red Excitation 596nm，Emission 620nm，紅色熒光。

選擇熒光素主要考慮以下幾點：
a. 高消光系數（extinction coefficient）和光子產量（Quantum yield），這意味著光捕獲能力強和效率高；
b. 光穩定性較好；
c. 與常見光源和濾光器匹配性較好；
d. 不干擾抗體反映；
e. 水溶性以及pH穩定性。此外，還需要考慮到是否有毒性以及熒光素的顏色是否與背景顏色反差大對比鮮明等。

問：免疫酶標組織（細胞）化學實驗中常用的顯色液有哪些，各自特點是什么？
答：

1.DAB（Diaminobenzidine；3，3-二氨基苯聯胺）顯色液
DAB顯色液主要用于免疫過氧化物酶法（如酶標法、PAP法等），是廣泛應用的電子供體之一，較敏感，切片可脫水透明，半永久保存，且其終產物具嗜餓性，既可直接在光鏡下觀察，也可經OsO4處理后，增加反應產物的電子密度，適于電鏡下確定抗原存在的部位。但有幾點需注意：DAB溶解要完全，否則未溶解的顆粒沉積于標本上影響觀察；DAB濃度不易過高，否則顯色液呈棕色，增加背景染色，另外DAB有致癌作用，應盡量減少吸入和接觸次數，最好將DAB制成10倍貯存液，分裝于-20℃保存，應用時稀釋、過濾。操作時應戴手套，盡量避免與皮膚接觸，用后及時徹底沖洗，接觸DAB的實驗用品最好經洗液浸泡24h后使用。

2.CN（4-Cl-1-Naphthol，4-氯-1-萘酚）顯色液
4-Cl-1-萘酚的終產物顯示藍色。由于酒精可溶解4-Cl-1-萘酚顯色的組織標本，勿用酒精脫水。與DAB比較，CN敏感性略差，但因其終產物較局限，很少彌散，光鏡觀察較為適合。

3.AEC（3-amino-9-ethyl-carbozole, 3-氨基-9-乙基卡唑）顯色液
該顯色液作用后，陽性部分呈深紅色，加以蘇木精或亮綠等作為背景染色，則效果更佳。由于終產物溶于酒精和水，故需用甘油封固。AEC染色后的顏色比DAB好看，但是靈敏度比DAB低，而且保存時間短，易褪色。

4.TMB顯色液
TMB即四甲基聯苯胺（Tetrabenzidine）是一種脂溶性較強的基團，因此容易進入細胞與細胞器中的HRP反應，且由于這種高度的脂溶性，使其易形成多聚體，在HRP活性部位產生粗大的、深藍色沉淀物，這使得TMB成為組化實驗中的一種很好的發色團。同時反應產物的沉淀，使得HRP的活性部位更加暴露，利于酶氧化反應進行。TMB的反應產物為深藍色，利于光鏡觀察，且反應產物越聚越大，常超出單個細胞器的范圍（而DAB則被限制在其內），故TMB反應的檢測閾較低。由于上述優點，目前TMB常用于光鏡及超微結構水平的HRP及HRP-WGA神經投射的研究。需要注意的是：TMB顯色液中的A液和B液應在2h內新鮮配制。另外，TMB是一種較強的皮膚刺激劑，并有致癌的潛在可能，故使用時應帶手套及在通風條件下操作。

5.BCIP/NBT顯色液
是堿性磷酸酶的顯色底物。BCIP即5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸（5-bromo-4-chloro-3-indolyl -phosphate）。NBT即四唑氮藍（Nitro-Blue-Tetrazolium）,MW=818,為深藍色無定形微溶物質。當二者存在時，在堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase, AP）作用下，NBT被還原形成顯微鏡下可見的藍色或紫色沉淀。

問：如何增強IHC/ICC/IF實驗的特異性染色，減少非特異性染色？
答：為了獲得高質量的結果，在免疫染色中既要注意增強特異性染色，也要盡可能的減少或消除非特異性染色。在各種免疫染色中都必須注意以下幾個問題：

1.增強特異性染色的方法
a. 蛋白酶消化法：其作用是暴露抗原，增加細胞和組織的通透性，以便抗體與抗原最大限度的結合，增強特異性染色和避免非特異性染色。
b. 合適的抗體稀釋度：抗體的濃度是免疫染色的關鍵，如果抗體濃度過高，抗體分子遠遠多于抗原決定簇，可導致抗體結合減少，產生陰性結果。因此，必須使用一系列稀釋或作“棋盤式效價滴定”檢測抗體的合適稀釋度，以得到最大強度的特異性染色和最弱的背景染色。
c. 稀釋用緩沖液的種類、標本的固定和處理過程等也可影響稀釋度。所以合適的稀釋度應根據自己的情況測定。
d. 孵育時間：大部分抗體孵育時間為30-60min，必要時可4℃過夜（約18h）。溫育的溫度常用37℃，也可在室溫中進行，對抗原抗體反應強的以室溫為佳。37℃可增強抗原抗體反應，適用于多數抗體染色，但應注意在濕盒中進行，防止切片干燥而導致失敗。
e. 多層染色法：對弱的抗原可用間接法（雙層）、PAP和ABC法（三層）、四或五層PAP法或ABC法，或PAP和ABC聯合染色法等，可以很大程度的提高敏感性，獲得良好結果。
f. 顯色增敏劑的應用，如在過氧化物酶底物中加入氯化鎳，可提高顯色敏感度4倍。

2.減少或消除非特異性染色的方法
組織中非抗原抗體反應出現的陽性染色稱為非特異性背景染色，最常見的原因是蛋白吸附于高電荷的膠原和結締組織成分上。最有效方法是在用第一抗體前加制備第二抗體動物之非免疫血清（1：5-1：20）封閉組織上帶電荷基團而除去與第一抗體非特異性結合。必要時可加入2%-5%牛血清白蛋白，可進一步減少非特異性染色。

問：RNA免疫沉淀（RIP），免疫共沉淀（CO-immunoprecipitation，CO-IP），染色質免疫沉淀（Chromation immunoprecipitation，CHIP）的區別是什么？
答： 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經典方法，是確定兩種蛋白質是否在生理條件下有相互作用的有效方法。其原理是：當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內存在的許多蛋白質－蛋白質間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內結合的蛋白質Y也能沉淀下來。這種方法常用于測定兩種目標蛋白質是否在體內結合；也可用于確定一種特定蛋白質的新的作用蛋白。

染色質免疫沉淀（Chromatin immunoprecitation，ChIP）,是研究體內DNA與蛋白質相互作用的重要工具。它的基本原理是在生理狀態下把細胞內的蛋白質和DNA交聯在一起，超聲波將其打碎為一定長度范圍內的染色質小片段，然后通過所要研究的目的蛋白質特異性抗體沉淀此復合物，特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段，通過對目的片斷進行PCR檢測，可以知道目的蛋白與那些基因作用。

RNA免疫沉淀(RIP).是研究體內RNA與蛋白質相互作用的重要手段。它的基本原理是在生理狀態下針對可以結合RNA的蛋白質進行免疫沉淀，然后通過分離抗體-Protein A/G beads復合物中的RNA成份，最后通過基因芯片或者其它手段檢測目的RNA。

由此可見，CO-IP和CHIP以及RIP都是基于IP的基本原理去實現不同的研究目的，CO-IP主要是研究目的蛋白X和與之發生相互作用的蛋白Y之間的作用關系；而CHIP主要是研究目的蛋白X和與之發生相互作用的DNA片段Y之間的作用關系；RIP主要是研究RNA結合蛋白和RNA之間的結合。這也就決定了在進行IP，CO-IP和CHIP以及RIP實驗時時操作步驟和涉及的緩沖液配方都有所不同。

問：免疫沉淀，免疫共沉淀（CO-immunoprecipitation，CO-IP），染色質免疫沉淀（Chromation immunoprecipitation，CHIP），RNA免疫沉淀（RIP）在實驗操作中所要注意的關鍵點分別是什么？
答：免疫沉淀：因為免疫沉淀的目的主要是通過抗體和目的蛋白相互作用從而捕獲目的蛋白，所以實驗中要注意的關鍵點是抗體和目的蛋白相互作用的效果。其主要受抗體的結合能力，目的蛋白和抗體的可接觸性兩個因素影響。所以免疫沉淀實驗中的關鍵因素是抗體的選擇以及裂解緩沖液中的配方。對于前者而言，抗體所針對的作用表位必須處于目的蛋白表面，對抗體結合力的要求和免疫印跡或者免疫熒光相比要高得多；對于后者而言，主要考慮因素是緩沖液中的去垢劑成分能否在不破壞目的蛋白天然構象的情況下（不影響目的蛋白和抗體的相互作用效果）將目的蛋白從細胞局部定位（比如位于某些細胞器中）中有效釋放出來。

免疫共沉淀：免疫共沉淀的目的是通過抗體和目的蛋白的相互作用從而捕獲目的蛋白復合物，最終檢測目的蛋白復合物中各成分之間的相互作用。所以實驗中要注意的關鍵點和免疫沉淀相比，除了要注意抗體和目的蛋白相互作用的效果外，還要注意目的蛋白復合物的完整性。后者主要考慮因素是緩沖液中的去垢劑成分能否在有效釋放目的蛋白復合物進入可溶相的情況下不破壞目的蛋白復合物中各成分之間的相互作用。所以，免疫共沉淀實驗中的關鍵因素除了抗體的選擇外，裂解緩沖液配方中的去垢劑的成分和濃度對免疫共沉淀實驗的成功與否至關重要，其選擇相比免疫沉淀實驗而言，要求更嚴格。

染色質免疫共沉淀：染色質免疫沉淀的主要目的通過抗體和目的蛋白的相互作用從而捕獲和目的蛋白有相互作用的DNA片段，最終檢測目的蛋白和DNA片段的相互作用。因此，實驗中要注意的關鍵點和前二者（免疫沉淀和免疫共沉淀）有所不同。因為在實驗中中蛋白質-DNA復合物的維持需要依靠多聚甲醛的交聯作用，所以目的蛋白的許多表面表位也在交聯過程中喪失。因此，除了后續的基本操作和免疫沉淀以及免疫共沉淀有些許不同，有額外需要注意的是向外，其對抗體的要求要比免疫沉淀和免疫共沉淀高得多，相對而言，裂解緩沖液的成份并不是關鍵因素。

問：該選擇什么樣的抗體進行免疫沉淀，免疫共沉淀（CO-immunoprecipitation，CO-IP），染色質免疫沉淀（Chromation immunoprecipitation，CHIP）及RNA免疫沉淀（RIP）實驗？
答：在所有免疫沉淀相關實驗中，抗原的起始濃度相對其它免疫相關實驗（WB和IF等）要低得多，所以對抗體的親和力相對其它實驗(WB和IF等)提出了很高的要求，這就需要使用高親和力的抗體去進行免疫沉淀相關實驗。同時，由于免疫沉淀相關實驗主要是在生理條件性進行，所以需要抗體識別蛋白的天然表面構象，因此選擇的抗體其針對的抗原決定蔟需要暴露在蛋白表面。這些因素對制備能成功應用于IP實驗的抗體提出了很高的要求：

a.用于免疫的蛋白抗原其構象需要盡量接近目的蛋白的天然構象或者用于免疫的多肽盡量暴露在目的蛋白的表面。獲得接近天然構象的蛋白抗原的途徑有很多，主要有天然提取，原核表達重組蛋白以及真核表達重組蛋白三種方式。
b.親和力要比普通的抗體應用要求高得多。多克隆抗體由于可以結合目的抗原的多個抗原決定簇，所以在親和力方面是首選。但考慮到特異性，獲得單克隆抗體群是更好的選擇。