問:NEB限制性內切酶進行DNA酶切時，酶切失敗或酶切不完全的原因及解決辦法有哪些？
答: 1.酶失活，酶應貯存在-20℃，-70℃貯存會凍結，另外反復凍融會降低酶活性。通常可用已知多位點對照DNA測試該酶活性。
      2.反應條件未優化，通常應按照推薦方法用限制性內切酶推薦緩沖液進行雙酶切或分步酶切（均經過試驗驗證確認方法是優化的）。
      3. 酶濃度過低，某些質粒或基因組DNA需要的酶量在10-20單位/ug。
      4. 添加物缺失，解決的辦法是重復操作，確保加入的酶或/和添加物（如BSA）
      5. DNA濃度不適，NEB推薦50ul反應體系使用1ug DNA，過量DNA會導致酶切不完全。
      6. 溫育時間過短，某些酶對特定的位點切割速率較慢，絕大多數情況下1-2小時最夠了。
      7.DNA被抑制劑污染，將底物DNA與對照DNA一起消化，如果存在抑制劑，則對照DNA不會被切割，銷量制備的DNA對抑制劑尤為敏感。 若被抑制劑污染，可過柱純化，層析，透析或增加反應體積降低抑制劑濃度。
      8.識別位點不存在，需驗證ＤＮＡ序列是否正確。
      9.酶切位點被甲基化封閉，某些位點會被甲基化阻斷，如果位點被阻斷，應使用dam+/dam-菌株轉化。另外真核基因組DNA可能被CpG甲基化阻斷，可將其克隆到細菌宿主以消除影響。
     10.DNA可能形成超螺旋，限制性內切酶消化超螺旋DNA效率是不一樣的，需加大酶量。
     11.識別位點過于接近DNA末端，一般在識別為點兩端各加上6個保護堿基，確保切割效率。
     12.位點優勢效應，需要兩個識別位點確保以達到有效切割。
問:NEB限制性內切酶進行DNA酶切時，若出現非預期帶型該如何解決？
答: 1.首先要確定正確的帶型，通常將對照底物DNA與酶切產物凝膠電泳，部分消化會有相應未消化底物條帶，星號活性會產生非預期條帶。
      2. DNA樣品污染，應重新制備DNA樣品。
      3.DNA含有其他識別位點，驗證DNA序列。
問:NEB限制性內切酶進行DNA酶切時，若DNA電泳呈現彌散狀該如何解決？
答:1.酶與DNA結合緊密未完全解離，在凝膠上樣緩沖液或反應終止液中加入SDS至終濃度為0.1-0.5%以幫助解離。
     2.核酸酶污染，操作時應注意避免交叉污染。
     3.瓊脂糖電泳條件不當，應使用新鮮緩沖液及合適電壓，避免過熱。
問:什么是同裂酶？
答:識別序列相同的限制性內切酶即為同裂酶。第一個被發現的內切酶稱之為原酶，后來發現的識別序列相同的內切酶稱之為同裂酶。
問:NEB采用藍冰運輸的好處有哪些？
答:

1.實驗證明，使用藍冰方法運輸，既使到貨時藍冰已經溶化，泡沫塑料盒中的溫度仍然能保持在4℃或4℃以下超過24小時。雖然NEB公司建議酶類產品貯存于-20°C，但在運輸過程中，溫度暫時維持在4°C至10°C之間不會對酶活性產生不良影響。事實上，在純化這些產品的過程中，為了去除蛋白酶和其他可能影響酶穩定性的污染源時，所使用的溫度就是4°C，并且純化過程通常需要持續3周之久。此外，每種酶都貯存于NEB特定的貯存液中，該貯存液經過優化，對保持酶活的穩定性也會起到重要作用。
2.NEB產品貯存液中含有50％甘油，可以使酶在-35°C下保持液態。但是如果使用干冰運輸，酶將被冷凍，如此反復凍融會導致蛋白質活性下降。
綜上所述，藍冰運輸比干冰運輸更能保證NEB產品的穩定性